基于高內涵顯微成像流式細胞儀的免疫學研究

感染時初始CD8+T細胞被激活、增殖分化為效應CD8+T細胞，并伴隨體溫升高。要知道體溫升高是否會進一步調控CD8+T細胞的激活分化，首先要解決對T細胞激活分化過程中的形態學變化進行定量分析。

Amnis公司ImageStream高內涵顯微成像流式細胞儀結合熒光顯微鏡和流式細胞儀的優點，可在快速分析大量細胞的同時獲得每個細胞的圖像，進行客觀定量的分析。我們知道，發燒的時候是機體正在對外來病原菌進行抵抗。以往我們只是知道高溫能夠抑制病原菌的復制能力。但是來自于美國紐約的羅茲韋爾公園癌癥研究所(RPCI)的免疫與流式細胞儀研究組近日的研究表明，發燒還能夠提高免疫系統的功能，確切的說，是CD8+T細胞的功能[Thomas A. Mace, JLB,2011]。

在這篇研究中，美國Amnis公司的ImageStream高內涵顯微成像流式細胞儀發揮了不可估量的作用，不僅完美的解決了傳統的流式分析和傳統圖像觀察的技術瓶頸，而且其強大的圖像定量分析能力也使之成為免疫學研究的利器。在炎癥或者受到病原菌侵染的時候，初始CD8+T細胞通過與APC細胞相互作用而被激活，進而增值、分化為效應CD8+T細胞，此激活過程可能會伴隨著體溫的升高。但是人們仍不了解體溫的升高是否又會進一步調控CD8+T細胞的激活和分化。

要解決這一問題，首先要解決的是如何對T細胞的激活和分化過程中的形態學變化進行定量分析。而美國Amnis公司推出的ImageStream高內涵顯微成像流式細胞儀使得這一問題迎刃而解：該系統結合了熒光顯微鏡和流式細胞儀的優點，能夠在快速分析大量的細胞的同時獲得每個細胞的圖像，并可以對這些圖像進行客觀、定量的分析。

近日，美國紐約的羅茲韋爾公園癌癥研究所《白細胞生物學雜志》雜志上發表了他們的研究結果：研究者利用ImageStream高內涵顯微成像流式細胞儀對較低體溫(33°C和37°C)以及較高體溫(39.5°C)下小鼠CD8+T細胞與APC細胞的結合情況進行了定量分析，結果表明，體溫升高后增強了二者的結合率。

另外更重要的是，研究者還發現實驗組小鼠CD8+T細胞數量顯著增加，并且其膜表面的GM1以及CD8共受體聚集成簇從而影響了膜的流動性。這些結果揭示了發燒引起的體溫增加能夠通過提高效應細胞群體的數量來影響抗原特異性CD8+T細胞所調節的應激效應。在該研究中，ImageStream顯示了其強大的圖像定量分析能力。

研究者首先從實驗小鼠體內分離了初始CD8+T細胞，然后分別在33°C、37°C以及39.5°C孵育6小時后，通過用ImageStream分析其細胞膜的流動性。由于ImageStream能夠對檢測到細胞進行成像，所以可以直觀的顯示出FITC標記的GM1蛋白均勻分布或成簇分布的情況(圖1B)。

通過軟件對整個群體細胞進行定量的圖像分析，研究者利用ImageStream軟件中的BrightDetail Intensity參數對細胞進行分析，發現溫度升高至39.5°C后細胞膜表面的GM1成簇現象明顯增加(圖1C)。另外，有報道表明T細胞激活時TCR信號復合體也會在細胞膜表面成簇。因此，研究者也對該復合體進行了分析，同樣獲得了類似的結果(圖1G和圖H)。

為了檢測溫度是否會影響CD8+T細胞與APC細胞二連體的形成，研究者將初始CD8+T細胞分別在37°或39.5°C 孵育6小時，然后和C57BL/6脾細胞共培養，實驗組用gp10025-33多肽處理。最后用ImageStream對發生免疫突觸的二連體細胞的數量進行分析。

首先通過明場和Aspect Ratio(細胞的短軸/長軸)設門區分單細胞和二連體細胞(圖2A和B，R1為單細胞，R2為二連體細胞)，然后通過CD8+Thy1.1+ (即 CD8+ T cells)和CD11b+ (即APC) 的表達進行設門圈選出T細胞和APC的雙聯體細胞(圖2C)。實驗結果表明，溫度的升高使CD8+T細胞與APC二連體細胞的比例顯著增加(圖2D)。

圖2.溫度的升高導致CD8+T細胞和APC細胞的二連體的比例增加

接下來，研究者希望探究CD8+T細胞的共受體是否也會隨著溫度的增加而聚集成簇。該共受體分子也和TCRβ一樣，是對CD8+T細胞激活非常重要的分子。通過研究證實了作者的猜測(圖3A和3B)。

圖3.小鼠的升高導致CD8+T細胞膜表面共受體成簇比例增加

同時研究者還利用ImageStream軟件中的Similarity參數對CD8共受體與GM1在細胞膜共定位情況進行了分析，但是結果表明小鼠體溫增加前后的similarity值沒有差異(數據未顯示)。為了進一步研究GM1在T細胞中的成簇情況，研究者分析了GM1和陰性對照CD71的共定位情況，結果表明在小鼠體溫增加前后similarity的值有所下降(右圖C和D)。圖像顯示CD71分子在小鼠體溫升高后并沒有和GM1共成簇(cocluster)，如右圖E所示。

最后，研究者認為CD8+T細胞及其分化為效應細胞的過程是對溫度敏感的。如果CD8+T細胞先處于較高的溫度下，然后接受到抗原刺激時會更加快速和有效的作出響應。在此類免疫學研究中，研究者遇到的最大的技術瓶頸就是如何對大量的細胞圖像進行定量分析并且獲得具有統計學意義的數據—因為傳統的流式細胞儀無法獲得細胞的形態學信息，而采用熒光顯微鏡需要通過人為進行判斷分析，統計的細胞數量非常有限。而美國Amnis公司推出的ImageStream高內涵顯微成像流式細胞儀完美的解決了這一問題，能夠快速、客觀的對蛋白轉位、分子共定位、形態改變、分子內吞、免疫突觸形成等形態學進行定量分析。